凱氏定（dìng）氮儀（yí）原（yuán）理和操作步驟

　　1.有（yǒu）機物中（zhōng）的胺根在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

　　反應（yīng）式為

　　2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做（zuò）催化（huà）劑）

　　2.在凱（kǎi）氏定氮（dàn）器中（zhōng）與（yǔ）堿作用，通（tōng）過蒸餾釋（shì）放出NH3，收集於H3BO3溶液中

　　反應式為:

　　（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4

　　2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O

　　3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據（jù）HCI消（xiāo）耗的量計（jì）算（suàn）出氮的（de）含（hán）量，然後乘以相應的換算因子，既得蛋白質的含量點焊機

　　反應式為：

　　（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

　　凱氏定氮儀操作步（bù）驟：（一（yī））消化1、準備6個凱（kǎi）氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶中分別（bié）加入適當濃度（dù）的蛋白溶液1.0mL，樣品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及（jí）瓶頸上。再（zài）依次加入硫酸鉀（jiǎ）-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫酸2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒（shāo）瓶（píng）作為空白對照，用以（yǐ）測（cè）定試劑（jì）中可能含有的微量（liàng）含（hán）氮物質，對樣品測定進行校正。4、5、6號燒（shāo）瓶（píng）中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其（qí）餘（yú）所加試劑與1、2、3號燒（shāo）瓶相同。2、將（jiāng）加好試劑的各燒瓶放置消化（huà）架上，接好抽氣裝置。先（xiān）用微火加熱煮沸，此時燒瓶內物（wù）質（zhì）炭化（huà）變黑，並產（chǎn）生大量泡沫，務必注意防止（zhǐ）氣泡衝出管（guǎn）口。待泡沫消失停止產生後，加大火力，保持瓶內液體微沸，至溶液澄清後，再繼續加（jiā）熱使消化液微沸15min。在消化過程中要隨時（shí）轉（zhuǎn）動燒瓶，以使內壁粘著（zhe）物質均能流入底部，以保證樣品完全消化。消化時放出的氣（qì）體內含SO2，具有強烈刺激（jī）性，因此自（zì）始自終應打開抽（chōu）水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應在通風櫥中（zhōng）進行。消化完全後（hòu），關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫（wēn）。（二）蒸餾和吸收蒸餾和吸收是在微量凱氏定（dìng）氮儀（yí）內進行（háng）的。

　　凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體（tǐ）上都由蒸氣發生、氨的蒸餾和氨的吸收三部分組（zǔ）成。

　　1、儀器的洗滌儀器安裝前，各部件需經（jīng）一般方法（fǎ）洗滌幹淨，所用（yòng）橡（xiàng）皮管、塞須浸在10%NaOH溶液中，煮約10min，水洗、水（shuǐ）煮10min，再水（shuǐ）洗數次（cì），然後（hòu）安裝並固定在一隻鐵架台上。儀器使用前，微量全部管道都須經水蒸氣洗滌，以除（chú）去管道內可能殘留的氨，正在使用的（de）儀器，每次測樣前，蒸氣洗滌5min即（jí）可。較長時間未使用的儀（yí）器，重複蒸氣洗（xǐ）滌，不得少於三次，並檢查（chá）儀器是否正常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先在蒸氣發（fā）生器中加約（yuē）2/3體積（jī）蒸餾水，加（jiā）入數滴硫酸使其（qí）保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，並放入少許沸石（或毛細管等），以（yǐ）防爆沸。沿小玻杯壁加入蒸餾水約20mL讓水經插管流入反應室（shì），但玻杯內的水不要放光（guāng），塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發生後，立即關閉（bì）廢液排放管上的開關，使蒸氣隻能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸（fèi）騰，蒸出（chū）蒸氣由反應室（shì）上端口通過定氮球進（jìn）入冷凝管冷卻（què），在冷凝管下端放置一個（gè）錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發燙開始計時，連續蒸煮5min，然後移開煤氣燈。衝洗完畢，夾緊蒸氣（qì）發生（shēng）器與收集器之間的連接橡膠管，由於氣體冷卻壓力降低，反應室內廢液（yè）自動抽到反（fǎn）應室外殼中，打開廢液排出口夾子放出廢液。如此清洗2～3次，再（zài）在冷凝管下換（huàn）放一個盛有硼酸-指示（shì）劑混合液的錐形瓶使冷凝管下口完全浸沒在溶液中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶內的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝（zhuāng）置內部已洗幹淨。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水（shuǐ）衝洗冷凝器下口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

　　2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收由於定氮操（cāo）作繁瑣，為了（le）熟悉蒸餾和滴定（dìng）的操作技術，初學者宜先用無機氮標準（zhǔn）樣品進行反複練（liàn）習，再進行有機氮未知樣品的測定。常用巳知濃度的（de）標（biāo）準（zhǔn）硫酸銨測試三次。取潔淨的100mL錐形瓶五隻，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基藍（lán）-甲基紅混合指（zhǐ）示劑（jì）（呈紫紅色）3～4滴，蓋好瓶口待用。取其中一隻錐（zhuī）形瓶承接在冷凝管（guǎn）下端，並使冷凝管的出口（kǒu）浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打開收集器活塞，以免錐形瓶內（nèi）液體倒吸。準確吸取2mL硫（liú）酸（suān）銨標（biāo）準液加到（dào）玻（bō）杯中，小心提（tí）起棒狀玻塞使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水衝洗小玻杯3次，一並放人蒸餾（liú）瓶中。然後用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使堿液慢慢流入蒸餾瓶中，在堿（jiǎn）液尚未完全流入（rù）時，將棒狀（zhuàng）玻塞蓋（gài）緊（jǐn）。向小玻（bō）杯中加約5mL蒸（zhēng）餾水，再慢慢打開（kāi）玻塞，使一半水流入蒸餾瓶，一半留在小玻杯中作水（shuǐ）封。關閉收集器活塞，加（jiā）熱蒸氣發生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由於吸（xī）收了氨，由紫紅色變成綠色。自變色時起，再（zài）蒸餾3～5min，移動錐形瓶使瓶內液麵離開（kāi）冷凝管下口約lcm，並（bìng）用（yòng）少量蒸餾水衝洗冷凝管下口，再繼續蒸餾1min，移開錐形瓶，蓋好，準備滴定。在一（yī）次蒸（zhēng）餾完畢後，移去煤氣燈，夾緊蒸氣發生（shēng）器與收（shōu）集器間的橡膠管，排除反應完畢的廢液，用水衝洗小玻杯幾次，並將廢液排除。如此反複衝洗幹淨後，即可進行下一個樣品的蒸餾。按以上方法（fǎ）用標準硫酸銨再做兩次（cì）。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形瓶一起滴定。

　　3、未知樣品及空白的蒸餾吸收將消化好的蛋白（bái）樣品三支，空白對照液三支，依次（cì）作蒸餾吸收。加（jiā）5mL熱的蒸餾水至消化好的樣品或空白對照（zhào）液（yè）中，通過（guò）小玻杯加到（dào）反應室中（zhōng），再用熱蒸餾水洗滌（dí）小玻杯3次，每次用水量約3mL，洗滌液一並倒入反應室內。其餘操作按標準硫酸銨（ǎn）的蒸餾進行。由於消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱氏燒瓶內倒出，必須加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結晶析（xī）出，必須微熱溶解，趁熱加入玻杯（bēi），使（shǐ）其（qí）流入反應（yīng）室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未完全冷卻時立即加入樣品（pǐn）或空白對照液，否（fǒu）則消化液通過（guò）冷卻的（de）管道容易（yì）析出結晶，造成堵塞。（三）凱氏定（dìng）氮儀滴定樣品和空白蒸（zhēng）餾完畢後，一起進行滴定。打開接受瓶蓋，用酸式微量（liàng）滴定管以0.0100mol/L的標準鹽酸溶液進行滴定。待滴至瓶內溶液呈（chéng）暗灰色時，用（yòng）蒸餾（liú）水將（jiāng）錐形瓶內壁四周淋洗一次。若振搖後複（fù）現綠色，應再小心滴入標準鹽（yán）酸溶液半滴，振搖（yáo）觀察瓶內溶液顏色變化，暗（àn）灰色在一二分鍾內不變，當視為到達滴定終點。若（ruò）呈粉紅色，表（biǎo）明（míng）已超（chāo）越滴定（dìng）終點，可在已滴（dī）定耗用（yòng）的標準鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的定氮終點顏色必須完全一致。空白對照液接受瓶內的溶液顏色不變或（huò）略有變化尚未出現綠色，可以不滴（dī）定（dìng）。記錄每次滴定耗用標（biāo）準鹽酸溶液毫升數，供（gòng）計算用。