無菌檢測儀不使用（yòng）集菌儀和使用集菌儀的差別

　　OOS(outofspecification,超限度、超規格（gé）)結果，是指產品質量指標測試中超出已經建立的（de）可接受標準的單個或一係列結果。無菌產品（pǐn）的陽性結果、微生物限度試驗超出行動值（zhí）或超過規格、內毒素試驗結果超標準等均為OOS結果《中國藥典》2015年版m和新版（bǎn）《藥品生產質量管理規範》（GMP)增加（jiā）了OOS調查章節，對微（wēi）生物實驗室00S結果的調查做出了較為詳細的闡述和實例分析（xī），要求任何OOS結果必須按照書麵規程（chéng）進行完整的調（diào）查。因為隻（zhī）有（yǒu）確定了OOS結果產生的原因並判定其是否有效，進而才能製訂完善的預防和（hé）整改措施，以保證檢驗結果的準（zhǔn）確性。因此，實驗室建立OOS調查處（chù）理程序，對OOS結果進（jìn）行科學、及時、有效的調查分析處理是十分必要的微生物在自（zì）然環（huán）境中無處不在，並可能會隨檢驗人員、檢驗用器材以及檢品的包裝容器進入檢驗環境。因此，關於微生物檢驗中（zhōng）藥品的無菌（jun1）檢査項目，新版藥典對（duì）其操作環境提出了更高要求，新版GMP也加強了對無菌操作環境空氣微生物（wù）、表（biǎo）麵微生物（wù）以及人員手套和操作服表麵微生物的監測（cè）頻率，並做出了（le）明確規定（dìng）。而對於無菌（jun1）檢査（chá）OOS結果的調査（chá），需核實的相關記錄和影響（xiǎng）因素更（gèng）為繁雜。基於它的複雜（zá）性，OOS結果的調查須追溯到實驗過程的每一個環節，而對於它的變異性，調查（chá）過程又需針對不同的OOS結果著重分析（xī）調查相應的不同環節。

　　對於微生物實驗室OOS的調查，局限於每個檢驗（yàn）單（dān）位的技（jì）術水平（píng）和資源，同樣限於人類對微生物掌握的局限，不是每次的OOS調査都可以發（fā）現其根本原（yuán）因，但通過此調査過程仍能（néng）夠幫助調查者找（zhǎo）出超標（biāo）結果發生的可能原（yuán）因並進而采取糾正預防措施，基於風（fēng）險分析，對相關批次產品做出（chū）最後處理決定'從而降（jiàng）低藥（yào）品質量風險，既是保證藥品（pǐn）質量的重要工作，又是質量體係持續改進的原（yuán）動力。本文通過對4批無菌（jun1）產品的無菌（jun1）檢査實驗全過程的回顧性分析和（hé）調查，探索（suǒ）導致（zhì）無菌實驗OOS結果的明確（què）原因，以期建立（lì）微（wēi）生物實驗室完善的OOS調査方案。

　　1、材料、儀器與試劑

　　全自動智能無菌集菌儀(上海秉越（yuè）zw-2008)一次性使用全封閉集菌培養器顯微鏡AxiosescopeA

　　全自動微生物鑒定儀

　　酵母菌鑒定卡

　　無菌（jun1）檢查樣品為（wéi）4個批號的注射用頭孢噻膀鈉。

　　2、方法與結果

　　2.1實驗方法

　　2.1.1藥品的無菌檢查

　　依（yī）照《中國藥典》2010年版_檢驗注射用頭孢噻肟鈉的（de）無菌檢查項目。

　　2.1.2鏡（jìng）檢及鑒定

　　取陽性樣本，劃線TSA平板（bǎn）培養24~48h，按（àn）照儀（yí）器及試劑的使用說明（míng），對經（jīng）過純化的微生物進（jìn）行革蘭氏染色，確定微生物形態，然後根據形態選擇鑒定卡（kǎ），使用全自動微生物鑒定儀Vitek2Compact進行鑒定（dìng）。

　　2.2結（jié）果

　　4個批號的注射用頭孢噻肟鈉的無菌檢查檢（jiǎn）驗結（jié）果如表1所示：2號和4號（hào）樣品改良馬丁培養基均在（zài）第（dì）3天變渾（hún）濁。取改良馬（mǎ）丁培養液（yè）劃線TSA平板，30~35℃培（péi）養48h，平板上呈現白色、光滑、邊緣整齊（qí）、形態單一的菌（jun1）落。

　　革蘭氏染色（sè）鏡檢結果為酵母菌（jun1）。經全自動微（wēi）生物鑒定儀Vitek2Compact鑒定，均為季也蒙假（jiǎ）絲酵（jiào）母。

　　3、OOS結果的調查和分析

　　依（yī）據新版（bǎn）GMP對OOS調查的要求，回顧性分析（xī）調查注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查OOS結（jié）果產生的原因。

　　①日常監（jiān）控（kòng）和驗收記錄（lù）：

　　培養基的驗收記錄、培養基的製備和滅菌記錄、檢驗器具準（zhǔn）備和滅菌記錄、消毒（dú）液配置和無菌過（guò）濾記錄、潔淨室清潔消毒記錄（lù）、檢驗員使用潔淨（jìng）服的滅菌記（jì）錄和使用記錄、無菌（jun1）檢驗（yàn）操作記錄以及環境監控（kòng）記錄等均未發（fā）現異常。

　　②人員（yuán）：

　　甲和乙（yǐ）實驗人員均能熟練掌（zhǎng）握無菌檢驗的流程（chéng）、監控（kòng）要點和無菌操作規範。

　　③樣品：

　　確認樣品的編號和批號無誤，無（wú）菌檢査取樣前，樣品西林（lín）瓶外觀正常，西林瓶蓋並未發現鬆動（dòng）的跡象。

　　④實（shí）驗器具：

　　實驗中使用的py330集菌器、一次件（jiàn）使用（yòng）無菌注射器以及一次性使用（yòng）無菌手套的無（wú）菌驗收均符合規定，且用於（yú）當（dāng）天其他檢品的檢驗（yàn），並未發現汙染情況。

　　⑤培養基及衝洗液和稀釋液：

　　無菌檢查用培養基的陰性（xìng）對照均符合規定，且同批製備和滅菌的（de）培（péi）養基用於（yú）同日檢查的其他檢品，並未（wèi）發（fā）現汙染情況。

　　⑥檢驗環境：

　　現場環境監控的3皿沉降菌監測的TSA平皿均未有菌落生長，並未出現汙染情況（kuàng）。定期環境檢測表麵菌符（fú）合規定，樣品無（wú）菌檢查當日潔淨空調係統均運行正常。

　　⑦不同檢驗體係對結果判定造成（chéng）的影響：

　　由於現行（háng）《中國藥典》無菌（jun1）檢查使用的改良馬丁培（péi）養基不同（tóng）於（yú）國際標準使用（yòng）的（de）TSB,將改良馬丁培養（yǎng）物劃線TSA平板上長出的菌落接種至TSB培養液中in),24h後培養液即出現混濁現象。因此可以排除因檢驗體係不同造成的實驗結果偏（piān）差。

　　⑧菌株：

　　樣品檢出菌經鑒定為季也蒙假（jiǎ）絲酵母菌，比對曰常潔淨室監控收集的菌（jun1）株建立的菌庫，潔淨室中從未監測到此種菌株。

　　⑨附加實驗的結果與分析：

　　通過以上分析，初步認定無菌不合格為實驗（yàn）有效結果（guǒ）。但鑒於此次無菌檢驗過程並未嚴格按照（zhào）新版GMP和（hé）《中國藥典》2015年版規定的對檢驗環境和人員（yuán）的全麵監控，環境和人員帶來的汙染（rǎn）仍有造成OOS結果的可能性，附加實驗就是對檢（jiǎn）驗環（huán）境進行全麵監測（cè）。

　　現場（chǎng）環境監控按照新版GMP的要求實施，並增加對潔淨室回風口浮遊菌的監測，監測結（jié）果均符合規定。微生物監測方麵，除實驗人員無（wú）菌服（fú）胸口處采集到一個（gè）菌落，其（qí）他均未有菌落生長。實（shí）驗（yàn）人（rén）員（yuán）無（wú）菌服采集到的菌落為革蘭氏陽性球菌，經鑒定為Kocuriakristinae(克氏庫克菌），此菌種曾在日常潔淨室監控中不止一次檢出過，並未對樣品產生過汙染。

　　4、結論與討論

　　OOS結果表明，並未在實驗室發現導致OOS結果的明確原因，檢出菌也並非由於實驗室檢驗過程（chéng）帶來的汙染，懷疑樣品本身被季（jì）也蒙假絲酵母菌所汙染，從而導（dǎo）致無菌檢查的陽性結果。

　　通過對（duì）上述（shù）OOS的調（diào）查和分析，初步建立（lì）了（le）微生物實驗室OOS結果調查的分析方案（àn），分別從人、機（jī）、料、法、環5個方（fāng）麵（miàn）進行闡述：

　　人——實驗人員。考察人員是否經過相關檢驗的培訓和考核，是（shì）否了（le）解該項檢驗的流程和監控要點。無菌區（qū）全體人員（yuán）每（měi）年應進行一次再培訓和資格的（de）再（zài）確認，對無菌區人員操作服和手套表麵的微生物（wù）監測嚴格按新（xīn）版GMP執行；

　　機——實驗中使用的儀器設備。檢（jiǎn）查集菌儀等儀器近期使（shǐ）用記錄是否發現異常，參數設置是否正確。儀器的計量和校準均需在有效期內，無菌區內使（shǐ）用的儀器需定期消毒並定期進行微生物的表麵監測，使用的（de）器具需經滅菌消毒，一次性使用器具需經質量驗收；

　　料——樣品、培養基、稀釋液和（hé）衝洗液。檢查剩餘樣品的編號和批號是否準確，樣品的外觀是否（fǒu）異常，瓶蓋是（shì）否有鬆脫現象以及樣品的前期存放條件和取樣（yàng）方式是否（fǒu）合理。必要時，對樣品的瓶蓋和（hé）瓶口等關鍵部位（wèi）擦抹取樣，培養觀察；

　　檢查培養基質量驗收記錄和配製記錄，確認配製和滅（miè）菌是否合理有效，是否用於其他樣品的檢驗，培養基、稀釋液和（hé）衝洗液的陰性對照應符合規定；

　　法——檢驗方法和依據。實驗所用標準應符合設定實驗和檢驗依（yī）據的要求（qiú）；

　　環——實驗（yàn）環境（jìng）。檢查潔淨空調係統是否運行正常（cháng），監測記錄包括（kuò）定期（qī）監控記錄（lù）和實驗現場環境監控記錄，是否符合潔淨度要（yào）求，清潔記錄顯示是否按時清潔，消毒液是否使用合理（lǐ）。另外，未（wèi）確定OOS結果產生的明確原因時，不能（néng）急於對環境進（jìn）行消毒處理，以免忽略了可能的環境（jìng）汙染因素。

　　微生物負荷和實驗檢（jiǎn）出菌的比對分析（xī）。實驗室的微生物負荷，包括潔淨室的空氣微生（shēng）物、表麵微生物和人員操作服及手套的表麵微生物。對日常環境監控收集的菌株進行有效鑒別和（hé）分析，建（jiàn）立潔淨室生（shēng）物負載數據庫，可為微生物OOS調査提供數據基礎。

　　對檢（jiǎn）出菌進行鑒定，分析（xī）監控收集的（de）微生物分布和（hé）鑒定與陽性結果的（de）相關性，當發（fā）現與（yǔ）陽性菌株相近的（de）菌株時，可利用分（fèn）子生（shēng）物學方法比對陽性菌株與微生物負荷的（de）同源性，為陽性菌的汙染溯源提供依據。

　　此外，對不同實驗會產生不同的OOS結果，可針對某些相關環節靈活考察。例如，針（zhēn）對不（bú）同的微生物，采（cǎi）用（yòng）不（bú）同的監（jiān）測（cè）手段，陽性檢出菌為酵母菌時，增加沙氏葡萄糖瓊脂用於環境監控的附加實驗，則能夠更好（hǎo）地確認環境中的該（gāi）類微生物。

　　需要著重（chóng）強調的是，檢出（chū）菌的鑒別對於（yú）OOS結果的調（diào）查非常關鍵，決定最後是否可以發現根本原因，應該給予足（zú）夠重視。

　　綜上所述，微生物相（xiàng）關檢驗項目OOS結果的調查工作（zuò）量很大，且專業性強，實驗（yàn）室（shì）不僅需要具備受（shòu）過良好培訓和（hé）具有豐富檢驗經驗的工（gōng）作人員，還需建立完善的OOS調查方案來（lái）規範調查操作。