微生物純培養與生（shēng）長量測定

　　一、微生物純（chún）培養技術

　　微生物（wù）在自（zì）然界中不僅分布廣，而且種類（lèi）多，並多是混雜地生（shēng）活在一（yī）起。要想研究或利用某一微生物，必須把混雜的微生物（wù）類群分離開來，以得（dé）到隻含一種微生（shēng）物的純培養。微生物學中將在實驗室條件下由一個細胞或一種細胞群繁殖（zhí）得到的後代稱為微（wēi）生物的純培養。

　　純培養技術包括兩個基本（běn）步驟：①從自然環（huán）境中分離培養對象。②在以培養（yǎng）對象為唯（wéi）一生物種類的隔離環境中培養、增殖，獲得（dé）這一生物種類的細胞群體。針對不同微生物的（de）特點，有許多分離方（fāng）法。應用最廣的是平板法分離純培養。

　　（一）、用固體培養基分（fèn）離純培養

　　單個微生物在適宜（yí）的固體培（péi）養（yǎng）基表麵或內部生長（zhǎng）、繁殖到一定程（chéng）度可以形（xíng）成肉眼可見的、有一定形態結構（gòu）的子細胞生長群體，稱為菌落（colony）。當（dāng）固體（tǐ）培養基表麵眾多菌落連成一片時，便成為菌苔（lawn）。不同微生物（wù）在特定培養基上生長形（xíng）成的菌落（luò）或菌（jun1）苔一般都具有穩定的特征，可以成（chéng）為（wéi）對該微生物進行分（fèn）類、鑒定的重要依據。大多數細菌、酵母菌、以及許多真菌和單細胞藻類能在固體培養基上形成孤立的菌落，采用適宜的平板分離法很容易得到純培養。所謂平（píng）板（bǎn），即培養平板（culture plate）的簡稱，它是指固（gù）體培養基倒入無菌平皿，冷卻（què）凝固後，盛固體培養基（jī）的平皿。這方法包括將單個微生物分（fèn）離和固定在固體培養基表麵或裏麵。固體培養基用瓊脂或其它凝（níng）膠物質固化的（de）培養基，每個孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌（jun1）落便於移植。最常（cháng）用的分離、培養微生物的固體培養基是瓊脂固體培養基平板。這種由Kock建立的采用平板分離微（wēi）生物純培養的（de）技術簡便易行，100多年來（lái）一直是各種菌種分離的最常用手段。

　　1.稀釋倒平（píng）板法（pour plate method）

　　先將待分離的（de）材（cái）料用無菌水作一係列的（de）稀釋（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然後分別取不同稀釋（shì）液少許，與（yǔ）已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固（gù）後（hòu），製成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一（yī）定時間即可出現菌落。如果稀釋得（dé）當，在平板表麵或瓊（qióng）脂培養（yǎng）基中就可（kě）出現分散的單個（gè）菌落，這個菌（jun1）落（luò）可能就是（shì）由一個細菌細胞繁殖形成的。隨後挑取（qǔ）該單個（gè）菌落，或重複以上操作（zuò）數次，便可（kě）得到純培養。

　　2.塗布平板（bǎn）法（spread plate method）

　　由於將含菌材（cái）料（liào）先加到還較燙的培養基中再倒（dǎo）平（píng）板易造成某些熱敏感菌的死（sǐ）亡，而且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格（gé）好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣（qì）而影響其生長（zhǎng），因此在微生物學研究（jiū）中更常用（yòng）的純種（zhǒng）分離方法是塗布平板法。其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平（píng）皿，製成無菌平板（bǎn），冷卻凝固後，將一定量的某一稀釋度（dù）的樣品（pǐn）懸液滴（dī）加在平（píng）板表麵，再（zài）用無菌玻璃塗棒將菌液均勻分散至整個平板表（biǎo）麵，經培（péi）養後挑取單個菌落（圖2-4）。

　　3.平板劃線法（streak plate method）

　　用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板（bǎn）表麵進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線（xiàn），微生物細胞（bāo）數量將隨著劃線次數的增加而減少（shǎo），並逐步分散開來，如果劃線適宜的（de）話，微生物能一一分散，經培養後，可在平板（bǎn）表麵得到單菌落。

　　4.稀釋搖管法（dilution shake culture method）

　　用固體培養基分離嚴格（gé）厭氧菌有它特殊的地方。如果該微生（shēng）物暴露於空（kōng）氣中不立即死亡，可以采用通常的方法製備平（píng）板，然後置放在封閉的容器中培養，容（róng）器中的氧（yǎng）氣可采用化學、物理或（huò）生物的方法清（qīng）除。對於那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的（de）分離（lí）則可采用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋（shì）倒平板法的一種變通形式。先將一係列盛無菌瓊（qióng）脂培養基的試管（guǎn）加熱（rè）使瓊（qióng）脂（zhī）熔化（huà）後冷卻並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管（guǎn）進行梯度稀釋，試（shì）管迅（xùn）速搖動均勻（yún），冷（lěng）凝後，在瓊脂柱表（biǎo）麵傾倒一層滅菌（jun1）液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空（kōng）氣隔開。培養後（hòu），菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一隻滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出（chū），再用一隻毛細管插入瓊脂和管壁之（zhī）間，吹入無菌（jun1）無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂（zhī）柱切成薄片進行觀察和菌落（luò）的移植。

　　（二（èr））、用液體培養基分離純培養

　　對於大多數（shù）細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因（yīn）為它們的大多數種類在固體（tǐ）培養（yǎng）基上長得很好。然而迄今為止（zhǐ）並不是所有的微生物都能在固體培養基上生（shēng）長（zhǎng），例如一些細胞大的細菌、許多原生動物（wù）和藻類等，這些微生物仍需（xū）要用液體培養基分離來獲得純培養。

　　通常采用的液體培養（yǎng）基分離純化法是稀釋法（fǎ）。接種物在液體培養基中進行順序稀釋，以得（dé）到（dào）高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到一個微生物（wù）。如果（guǒ）經（jīng）稀（xī）釋後的大多數（shù）試管（guǎn）中沒有微生物生長，那麽有微生物生長的試管得到的培養物可（kě）能就是純培養物。如果經稀釋後的（de）試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的機率（lǜ）就會急劇下降。因此，采（cǎi）用稀釋法進行液（yè）體（tǐ）分離，必須在同一個稀釋度的許（xǔ）多平行試管中（zhōng），大多（duō）數（一般應超過95%）表現為不生長。

　　（三）、單細胞（孢子）分離

　　稀釋法（fǎ）有一（yī）個重要缺點（diǎn），它隻能分離（lí）出混雜微生物群體中占數量（liàng）優勢的種類，而在自然界，很多微生物在（zài）混雜群體中都（dōu）是少數。這時，可（kě）以采取顯微分離法（fǎ）從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲（huò）得純培養，稱為單細胞（或（huò）單孢子）分離法。單細胞分離法的難（nán）度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。

　　對於較（jiào）大的微生物，可采用毛細管提取單個個體，並在大量（liàng）的滅菌培養基中（zhōng）轉移清（qīng）洗幾次，除（chú）去較小微（wēi）生物（wù）的汙染。這項（xiàng）操作可在低倍（bèi）顯微鏡，如解剖（pōu）顯微鏡下進行。對於個體相對較小的微生物，需采用（yòng）顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯（xiǎn）微操作儀種類很多，一般是通過（guò）機械、空氣或油壓傳動裝（zhuāng）置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛（máo）細管或顯微針、鉤、環（huán）等（děng）挑（tiāo）取單（dān）個微生物細胞或孢子以獲得純培養（yǎng）。在沒有顯微操作儀（yí）時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進（jìn）行單細（xì）胞（bāo）分離，例如（rú）將經適當稀釋後的樣（yàng）品（pǐn）製備成小（xiǎo）液滴在顯微鏡下觀（guān）察，選取（qǔ）隻含一個細（xì）胞的液體來進行純培養物的分離（lí）。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限於高度專業化（huà）的科學研究中采用。

　　（四）、選擇培（péi）養分離

　　沒（méi）有（yǒu）一種培養基或一種培養條件能夠滿足自然界中一切生（shēng）物生長的要求，在一定（dìng）程度上所有的培（péi）養基都是選擇性的。在一（yī）種培養基（jī）上接種（zhǒng）多種微生物，隻有能生長的才生長，其它被（bèi）抑（yì）製。如果某種微生物的生長需要是已知的（de），也可以設計一套特（tè）定環境使之特別適合這種（zhǒng）微生物（wù）的生長，因而（ér）能夠從自然界混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，盡管在混雜的微生（shēng）物群體中這種微生物可能隻占少數。這種通過選擇培養（yǎng）進行微（wēi）生物純培養（yǎng）分（fèn）離的技術稱為選（xuǎn）擇（zé）培養分離，是十分重要的，特（tè）別對於從自然界中分離、尋找有用（yòng）的微（wēi）生物（wù）。在自然界中，除了極特殊的情況外，在大多（duō）數（shù）場合下微生物群落是由多種微生物組成的（de），因此，要（yào）從中分離出所需（xū）的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方（fāng）法幾乎是（shì）不可能分離到該種微生物的。例如，若某處的土壤中的微生物數量（liàng）在10８時，必須稀釋到10-6才有可（kě）能（néng）在平板上分離到單菌落，而如果所需的微生物的數量僅為10２-３，顯然不可（kě）能在一般（bān）通用的平（píng）板上得到該微生物（wù）的單菌落。要分離這種微生物，必須根據（jù）該微生物的特點，包括營（yíng）養、生理、生長條件等，采用選擇培養分離的方法。或抑製使大（dà）多數微生物不能生長，或造成有利於該菌生長的環境，經過一定時間培養後使該菌在群落中的數量上（shàng）升，再通（tōng）過平板（bǎn）稀釋等方法對它進行純培養分離。

　　1.利用選擇平（píng）板進行直接分離

　　主要根據待分離微生物的特點選擇不同的培養條件（jiàn），有多種方法可（kě）以采用。例如在從土壤中篩選蛋白酶產生菌時，可以在培（péi）養基中（zhōng）添加牛奶或酪（lào）素製備培養基平板，微生物生長（zhǎng）時若產生蛋白酶則會水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白質水解圈。通過菌株培養時產生的蛋（dàn）白質（zhì）水（shuǐ）解圈對產酶菌株進行篩選，可（kě）以減少工作量，將那些大量的非產（chǎn）蛋白酶（méi）菌株淘汰；再如，要分離高溫菌，可（kě）在高（gāo）溫條件進行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表麵或裏麵滑行，可以（yǐ）利用它們的滑動特點進行（háng）分離純化，因為滑行能使它（tā）們（men）自（zì）己和（hé）其它不（bú）能移動（dòng）的微生物分開。可將微生物群落點種到平（píng）板上，讓微生物（wù）滑行，從（cóng）滑行前沿挑取接種物接種，反複進（jìn）行，得到純培養（yǎng）物。

　　2.富集培養

　　主要是指利用不同微生物間（jiān）生命活動（dòng）特點的不同，製（zhì）定特定（dìng）的環境條件，使僅適應於該條件的微（wēi）生物旺盛生長，從而使其在群落中的數量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需（xū）的特定微生物（wù）。富集條件可根據所需分離的微生物的特（tè）點從物理、化學、生物、及（jí）綜合多個方麵進（jìn）行選擇，如溫度、pH、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養等等許多方麵。如采用富集（jí）方法從（cóng）土壤中分離能降解酚類化合物對羥基（jī）苯甲酸的微生（shēng）物的實驗過程。首先配製以對羥基苯甲（jiǎ）酸為唯一碳源的（de）液體（tǐ）培養基並分裝於燒瓶中，滅菌後將少量的土（tǔ）壤樣品接種於該液體培養基中，培養一定時間，原來（lái）透明的培養液會變得渾濁，說明已（yǐ）有大量微生物（wù）生長。取少量上述（shù）培養液轉移至新鮮培養（yǎng）液中重新培養，該（gāi）過程經數次重複後能利用對羥基苯甲（jiǎ）酸的微生（shēng）物的比例在培養物中將大大提（tí）高，將培養液塗（tú）布於以對羥基苯甲（jiǎ）酸為唯一碳源（yuán）的瓊脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能（néng）降解對羥基苯甲酸的（de）微生物。挑取一部分單菌（jun1）落分別接種到含有及缺乏對羥基苯甲（jiǎ）酸的（de）液體培（péi）養基中（zhōng）進行培（péi）養，其中（zhōng）大部分在含有對羥基苯（běn）甲酸的培養基中生長，而在沒（méi）有對羥基（jī）苯甲酸的培養（yǎng）基中表現為沒有生長，說明通過該富集程序的確得到了欲分離的目（mù）標（biāo）微生物。通過富（fù）集培養使原本在自然環（huán）境中占少數的微生物的數（shù）量大大提高後，可（kě）以再通（tōng）過稀釋倒平（píng）板或平板劃線等（děng）操（cāo）作得到純培養物（wù）。

　　富集培（péi）養是微生物學家最強有力的技術手段（duàn）之一。營養和生理條件的幾乎無窮盡的組合形式可應（yīng）用於從自然界（jiè）選擇出（chū）特（tè）定微生物（wù）的需要。富集（jí）培養方法（fǎ）提供了按照意願從自然界分離出特定已知微生（shēng）物種（zhǒng）類的有（yǒu）力手段，隻要掌握這種微生物的特殊要求（qiú）就（jiù）行。富集培養法也可用來分（fèn）離（lí）培養出（chū）由科學家設計的特定環境中能生長的（de）微生物，盡管麻豆免费视频（men）並不（bú）知道什麽（me）微生物能（néng）在這種特定的（de）環境中生長（zhǎng）。

　　（五）、二元培養物

　　分離的目的通常是要得到純培養。然而（ér），在（zài）有些情況下這是做不到（dào）的或是很（hěn）難作到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。隻有一種微生物的培養物稱為純培養物，含（hán）有二（èr）種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養（yǎng）物中隻含有二種微生物，而且是（shì）有意識的保持二者之間的特定關係的培養物稱為二元培養物。例如二（èr）元培養物是保存病毒的最有效途徑，因為病毒是細（xì）胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞（bāo）的微生物（wù）也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或（huò）特殊的共生關係。對於這（zhè）些生物（wù），二元培養（yǎng）物是在實驗室控製條件（jiàn）下（xià）可（kě）能達到的最接近於純培養的培養方法。

　　在自然環境中（zhōng），獵食（shí）細小微生物的（de）原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘（zhān）菌。對這些生物，二者的關係可能並不是嚴格的。這些生物中有些能夠純培養，但是其營養要求往往極端複雜，製備純培養的培養基很困難、很費事（shì）。

　　二、微生物生長量的測定

　　微生物（wù）學研（yán）究（jiū）中常常要進行微生物生（shēng）長量的測定，有多種方法用於微生物生長（zhǎng）量的測定，概括起來常用的有以下幾種：

　　（一（yī））直接（jiē）計數法(又稱全（quán）數法)

　　1、計數器直接測數法

　　取定量稀釋的單細胞培養物懸液（yè）放置在血球計數板（bǎn）(細胞個體形態較大（dà）的單細胞微生物，如酵母菌等)或細菌計數板(適用於細（xì）胞個體形態較小的細菌)上，在顯微鏡下計數一定體積中的平均細胞數，換算出供測樣品的細胞數。

　　（1）血球計數板及細胞計數（shù）

　　血球計數板是一種在特定平麵（miàn）上劃有格子的特殊載片。在劃有格（gé）子的區域中（zhōng），有分別用（yòng）雙線和單線分隔而成的方格。其（qí）中有以雙線為界劃成的方（fāng）格25(或16)格，這（zhè）種以雙線（xiàn）為界的（de）格子稱為中格，其內有以（yǐ）單線為界的16（或25）小（xiǎo）格。因此，用於細胞計數的區域的總小格數為：25×16=400。該400個小格排成一正方形的大方（fāng）格，此大方格的每條邊的邊長為1 mm，故400個小格的總麵積為1mm２。

　　在（zài）進行細胞計數前（qián），先取蓋玻片蓋於計數方格（gé）之上，蓋玻片的下（xià）平麵與刻有方格的血（xuè）球計數板平麵之間留有0.1mm高度的（de）空隙。含（hán）有細胞的供測樣品液被加注在（zài）此空隙中。加（jiā）注在（zài）400個小格（1mm２）之上與蓋玻片之間的空隙中（zhōng）的液體總體積應為：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm３

　　一般（bān）表示樣品細胞濃度（dù）的（de）單（dān）位為（wéi）：億個/mL。因此，在計數（shù）後，獲（huò）得在400個小格中的細胞總數（shù），再乘以（yǐ）10４，以換算成每mL所含（hán）細胞數。其計算公式（shì）如下：

　　菌液的含菌數/mL=每小格平均菌數×400×10 000×稀（xī）釋倍數

　　在進行（háng）具體（tǐ）操作時，一般取五（wǔ）個中格（gé）進行計數，取格的方法一（yī）般有兩種：①取計數板斜角線相連的5個中格；②取計數板4個角上（shàng）的4個中格和（hé）計數板正（zhèng）中（zhōng）央（yāng）的1個中格。對橫跨位於方格邊線上的細胞，在（zài）計數時，隻計一個方格4條邊中的2條邊線上的細胞，而另兩條邊線上的細胞則不計；取邊的原則是每個方格均取上邊線與右邊線或下邊線與左（zuǒ）邊線。

　　圖3—5血球計數（shù）板方格示意（yì）圖

　　（2）細菌計數板及細胞計數（shù）

　　細菌計數（shù）板與（yǔ）血球計數板結構（gòu）大同小異，隻是（shì）刻有格子（zǐ）的計數板平麵（miàn）與蓋玻片之間的空隙高度僅0.02mm。因此（cǐ），計算方法稍有差異（見以下計算公式），餘者與血（xuè）球計數板（bǎn）法同。

　　菌液樣本的含菌數/mL=每小格平均菌數×400×50 000×稀釋倍（bèi）數

　　2、塗片染色計數

　　用計數板附帶的0.01mL吸管，吸取定量稀釋的細菌懸液（yè），放置刻（kè）有1 cm２麵積的玻片上，使菌液均勻地（dì）塗布在1cm２麵積上，固定後染色，在顯微鏡下任意選擇幾個乃至十幾個視野來計算（suàn）細胞數量。根據計算出的視野麵積核算（suàn）出每1cm２中的菌數，然後按1cm２麵積上的菌液量和稀釋（shì）度，計算（suàn）每mL原液中的含菌數。

　　原菌液的含菌數/mL=視野（yě）中（zhōng）的（de）平均（jun1）菌數×1cm２/視野麵積×100×稀釋（shì）倍數

　　3、比濁（zhuó）法（fǎ）

　　這是測定菌懸液（yè）中（zhōng）細（xì）胞數量的快速方法。其原理是（shì）菌懸液（yè）中的單細胞微（wēi）生物，其細胞濃度與混濁度成正比，與透光度（dù）成反比。細胞越多，濁度越大，透光（guāng）量越少。因（yīn）此，測定菌懸液的（de）光密度(或（huò）透光度)或濁度可以反映細胞（bāo）的濃度。將未知細胞數的懸液與已知細胞數的（de）菌懸液相比，求出未知菌懸液所（suǒ）含的（de）細胞數。濁度計、分光光度儀是測定菌懸液（yè）細胞濃度的（de）常用（yòng）儀器。此（cǐ）法比較簡便，但使用有局限性。菌懸液（yè）顏色不宜太深，不能混雜其（qí）他物質，否則不能獲得正確結果。一般在用此法測定（dìng）細胞濃度時（shí），應先用計數法（fǎ）作對應計數，取得經驗數據，並製作菌數對OD值的標準曲線方便查獲菌數（shù）值（zhí）。

　　（二）活菌計數法(又叫間接計數（shù）法)

　　活菌計數法又稱間接計數法。直（zhí）接計數法測定到的是死、活細胞總數，而（ér）間接計數法測得的僅（jǐn）是活菌數。這類（lèi）方法所得的數值往往（wǎng）比直接計數法測得的數值小。

　　1、平板菌落計數

　　此（cǐ）法是基於每一個分散（sàn）的活（huó）細胞在適宜的培（péi）養基中具有生長繁殖並能形成一個菌落的能力；因此，菌落數就是待（dài）測樣品所含的活菌數。

　　將單細胞微生物待（dài）測（cè）液經10倍係列稀釋後，將一定濃（nóng）度的稀（xī）釋液定量地接種到瓊脂平板培養（yǎng）基上（shàng）培養，長出的菌落數就是稀釋液中含有的活細胞數，可以計算出（chū）供測（cè）樣（yàng）品中的活細胞數。但應（yīng）注意（yì），由於各種原因，平板上的單個菌落可能並不是由一個菌體細胞形（xíng）成（chéng）的（de），因此在表達（dá）單位樣品含菌數時，可用單位樣品中形成菌落單位來表（biǎo）示，即CFU／mL或CFU／g(CFU即colony-forming unit)。

　　2、液體稀釋（shì）最大或然數法（fǎ）測（cè）數

　　取定量（liàng）（1mL）的單（dān）細胞微生（shēng）物懸液，用培養液作定量10倍係列稀釋，重複3－5次，將（jiāng）不同稀（xī）釋度的係列稀釋管置適宜溫度下培養。在稀釋度合適的前（qián）提下（xià），在菌濃（nóng）度相對較高的稀釋（shì）管內均出現（xiàn）菌生長（zhǎng），而自某（mǒu）個稀釋度較高的稀釋管（guǎn）開始（shǐ）至稀（xī）釋度更高的（de）稀釋管中均不出現菌生長，按稀（xī）釋度自低到高（gāo）的順序，把最後（hòu）三個稀釋度相對較高的、出現菌（jun1）生長的稀釋管之稀釋度稱為（wéi）臨界級數（shù）。由（yóu）3至（zhì）5次重複的連續三級臨界級數獲得（dé）指數，查相應重複（fù）的最大或然數(即most probable number，MPN)表求得最大可能數，再乘以（yǐ）出現生長的臨界級數的最低稀釋（shì）度（dù），即可測得比較可靠（kào）的樣品活菌濃度。

　　在實踐中，通常（cháng）以5管重複為一個組，故這裏僅列出5次（cì）重（chóng）複測（cè）數統計表。隻要知（zhī）道了數量指（zhǐ）標，就可查知近似（sì）值。

　　3薄膜過濾計數法

　　測定水與空氣（qì）中的活菌數量時，由於含菌濃度低，則使用微（wēi）生物限度檢測儀可先將待測樣品(一定體積的水或（huò）空氣)通過（guò）微孔薄膜(如硝化纖維薄（báo）膜)過濾濃縮，然後把濾膜放在適當（dāng）的（de）固體（tǐ）培養基上培養，長出（chū）菌（jun1）落後即可計數。

　　（三）細（xì）胞物質量測定法

　　1、幹重法

　　集菌儀過（guò）濾定量培（péi）養物用離心或過濾的方法將菌體從（cóng）培養基中分離出來，洗淨、經常壓或真（zhēn）空幹燥，幹燥溫度常采用105℃、100℃或（huò）紅（hóng）外線烘幹至恒重，也可在較低溫度（80℃或40℃）下真空幹（gàn）燥，然後精確（què）稱（chēng）重，即可計算出培（péi）養（yǎng）物（wù）的總生物量。過濾時（shí）絲狀真菌用（yòng）濾紙過（guò）濾，細菌用醋酸纖維膜等進行過濾。一般細菌幹重約為（wéi）濕重的（de）20％～25％。此（cǐ）法直接而又可靠，但要（yào）求（qiú）測定時菌體濃度較高（gāo），樣品中不含非（fēi）菌體的幹（gàn）物質。

　　2、含氮量測定法

　　細胞的蛋白質含量是（shì）比較（jiào）穩定的，可以（yǐ）從蛋白質含量的測定求出細胞物質量（liàng）。已知細菌細胞幹重的含氮量（liàng）一般為12%～15％，酵母菌為7.5％，黴（méi）菌為6.0％。一（yī）般細（xì）菌的含（hán）氮量約為原生質幹重的14％。而（ér）總氮量與細胞蛋白（bái）質總含量的關係可用下式計算：

　　蛋白（bái）質總量=含氮量百分比×6.25

　　3、DNA測定法

　　這種方法是基（jī）於DNA與DABA—2HCl(即新（xīn）配製的20％W／W，3,5—二（èr）氨基苯甲（jiǎ）酸-鹽酸溶液)結（jié）合能顯示特殊熒光反（fǎn）應的原理，定量測定培養物的菌（jun1）懸液的熒光（guāng）反應強度，求得DNA的含量，可以直接反映所含細胞物質的量。同時還可根據DNA含量計算出細菌（jun1）的數量。每個細菌平均含8.4×10－５ng DNA。

　　4、其他生理指標測（cè）定法

　　微生物新陳代謝的結果，必然要消耗或產生一定量的物質。因此也可以用某物質的消耗量或某產物的形成量來表示微生（shēng）物的生長量。例如通過測定微生物對氧的吸收（shōu）、發酵糖產酸量或CO２的釋（shì）放量，均可用來作為生長指標。使用這一方法時（shí），必須注意（yì）作（zuò）為生長指（zhǐ）標的那些生（shēng）理活動，應不受外界其他因素的影響或幹擾，以便獲得準確的結果。

　　從（cóng）上表中可（kě）以看出，每種方法都各有優點和局限性。隻有在考慮了這些（xiē）因（yīn）素同需（xū）要著手（shǒu）解決的問（wèn）題之間的關係以後，才能對具體的方法進行選擇。正如前麵說過的，平皿菌落計數法是微生物學中應用（yòng）最多的常規方法，掌握這一方法的原理和實際操作，很有必要。此法在理論上能（néng）反映（yìng）活（huó）菌數。另外當用兩種不（bú）同的方法測量細菌的生長量時，其結果不一致是完全（quán）可能的。

　　測定微生物的生長量，在理論和實踐上都十分重要。當麻豆免费视频要對細菌在不同培（péi）養基（jī）中或不同條件下的生長（zhǎng）情（qíng）況進行評價或解釋時，就必須用數量來表示它的生長。例如可以（yǐ）通過細菌生長的快慢來判斷某（mǒu）一條件（jiàn）是否適合。生長快（kuài）的細胞，最終的總收獲量（liàng）可能沒有另一些條件下的收獲量大。在另一些條件下（xià），生（shēng）長速率雖然較低（dī），但它卻可在一段時間內不斷增加。因此，隻有具（jù）備了有關生長的定量知識，才能（néng）在實（shí）際應用（yòng）中作出正（zhèng）確的選擇，以利於科研和生產活動的進一步開展。